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文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用
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摘要：癌症作为威胁人类健康及生命的严重疾病之一，其发生率和死亡率一直居高不下。其病因主要是肿瘤细胞基因组中的突变或遗传缺陷不断积累，引发肿瘤形成和促进肿瘤的发展演进。因
癌症作为威胁人类健康及生命的严重疾病之一，其发生率和死亡率一直居高不下。其病因主要是肿瘤细胞基因组中的突变或遗传缺陷不断积累，引发肿瘤形成和促进肿瘤的发展演进。因此修复肿瘤细胞基因或者沉默特定蛋白表达成为研究肿瘤发生发展过程以及开拓肿瘤治疗的重要手段。近年来，高通量测序和生物信息学技术的极速发展，为精准医疗背景下的肿瘤研究提供大量基因学信息。而CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简便、易于设计等特点，可为肿瘤相关基因的功能学研究提供新方法、新思路，进而更好地服务临床诊疗。
CRISPR/Cas9技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计3～10条sgRNA，利用芯片一次合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，在适当的筛选条件下测试筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出候选基因[1-3]。目前，科学家们已成功构建人源和鼠源全基因组文库且在日渐完善[4-6]，未来CRISPR/Cas9高通量文库筛选技术将得到前所未有的发展和应用。
1 CRISPR/Cas9系统原理及发展历史
CRISPR/Cas9 系统由Ⅱ型Cas9 核酸酶和single guide RNA（sgRNA）组成。Cas9与sgRNA形成的复合体能识别带有PAM（protospacer adjacent motif）（NGG或NAG）信息的互补序列，继而对靶DNA进行特异性切割，通过细胞内的非同源性末端连接机制（nonhomologous end joining,NHEJ）和同源重组修复机制（homologous recombination,HDR）对形成断裂的DNA进行修复，导致基因部分序列的插入或缺失，最终实现基因的定向编辑[7]。
日本生物学家首次在大肠杆菌中发现存在于iap序列下游29nt的串联间隔重复序列[8]。研究者发现该序列在大约40%的细菌和90%的古生菌中广泛存在。Jansen等[9]把这种串联重复序列正式命名为成簇间隔规律短回文重复序列（CRISPR）。Barrangou首次用实验证明CRISPR系统是细菌的一种适应性免疫系统[10]。Doudna 与 Charpentier在此基础上对 CRISPR/Cas9 系统进行改造，使其具备基因修饰功能，从而使CRISPR/Cas9成为继基因打靶技术、RNAi、ZFNs和TALENs后又一新兴基因编辑技术[11]。张峰团队首次利用改造的CRISPR/Cas9系统在人类细胞和小鼠细胞中成功完成基因组定点编辑[12]。南京大学用CRISPR系统敲除了小鼠EGFP基因，首次将CRISPR技术应用于哺乳动物[13]。近几年CRISPR/Cas9基因编辑技术受到科研人员的普遍认可，在医药、工业、农业等领域得到大量推广，涵盖基因敲除、敲入、转录激活、转录抑制、RNA编辑、全基因组筛选等众多基因编辑方向。
2 CRISPR/Cas9技术的改进与应用
2.1 拓展CRISPR/Cas9技术应用范围
国内外研究者近年来不断拓展CRISPR/Cas9技术的应用范围。加州大学研究人员首创利用CRISPR基因转录激活技术（CRISPRa）筛选影响T细胞免疫细胞发育的一种基因增强子，有助于解析自身免疫疾病的病理机制[14]；Church 研究组[15]在小鼠体内构建hgRNACas9系统，利用遗传条形码来记录发育中小鼠胚胎干细胞分裂的过程，追溯小鼠体内的单细胞谱系来源；亓磊研究组研发出CRISPR-基因组组装（CRISPR-GO）技术，为可编程地研究大规模空间基因组组织和功能提供一个良好的平台[16]。另有研究团队创造性应用CRISPR构建一种促进细胞内特定基因进化的平台EvolvR[17]，这种技术开辟了无数的可能性，如有效地将废物转化为生物燃料的工程酵母，或开发新的人类疗法。通过不断革新和优化，CRISPR/Cas9技术将为功能生物学、生物技术和基因治疗等各领域带来新的契机。
2.2 设计改造CRISPR/Cas9技术以降低脱靶效应
虽然CRISPR/Cas9技术优势显著，但其潜在的脱靶风险也影响着基因编辑技术的深入研究，为此研究人员努力通过设计改造Cas9蛋白结构和sgRNA序列等方法降低脱靶率。亓磊研究组首次将CRISPR改造为可干扰基因转录调控进程的强大工具，并命名为CRISPR基因转录干扰技术（CRISPRi）[18]。CRISPRi技术将Cas9蛋白的核酸酶结构域突变，使Cas9失去核酸内切酶活性而保留DNA结合活性，形成灭活的dCas9，这样不需要NHEJ等细胞修复途径即可进行编辑，从而降低脱靶风险[19]。除此之外，将CRISPR/Cas基因编辑酶与核酸脱氨编辑酶整合成一种新的碱基编辑系统（BE），可在单碱基水平对基因实现高效率的靶向编辑改造。如2018年上海科技大学研究人员开发出一系列基于人胞嘧啶脱氨酶APOBEC的新型普适碱基编辑器，其中基于人APOBEC3A（hA3A）的碱基编辑器可高效介导甲基化胞嘧啶mC到胸腺嘧啶T的编辑[20]。围绕Cas9特异性和sgRNA设计的科学态势正迅速发展，但CRISPR编辑技术的脱靶率仍未完全消除。如何在实现高编辑效率的同时降低甚至消除脱靶效应，这将是未来研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题。
文章来源：《知识文库》 网址: http://www.zswkbjb.cn/qikandaodu/2021/0316/779.html
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